Shp2及NK1R在肥大细胞活化过程中的作用及其分子机制研究

【摘要】第一部分Shp2在肥大细胞活化过程中的作用及其机制研究蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2参与了许多由免疫球蛋白受体介导的信号通路,并在其中中发挥了很重要的作用,但是Shp2在免疫球蛋白受体FcεRI介导的信号通路中所起的作用却没有被阐述。FcεRI主要分布在肥大细胞和嗜碱性粒细胞的表面,能与免疫球蛋白E(IgE)高亲和力结合。在特异性多价抗原的刺激下,FcεRI分子由于相互交联,在膜表面聚集继而被活化,由此起始胞内一系列信号级联反应,最终导致细胞活化。本研究利用Shp2表达下调的RBL-2H3肥大细胞,观察了Shp2在RBL-2H3肥大细胞活化过程中所起的作用,并进一步探讨了Shp2在其中的信号调节机制。我们的研究表明Shp2在RBL-2H3肥大细胞的活化过程中具有不可或缺的作用。抗原诱导FcεRI活化后,RBL-2H3细胞的脱颗粒、钙离子流以及各种细胞因子信使RNA(messageRNA,mRNA)的合成,包括白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β),白介素-10(interleukin-10,IL-10)和单核细胞趋化因子蛋白1(monocytechemoattractantprotein1,MCP-1),都由于Shp2的低表达而被显著抑制。采用免疫印迹(immunoblotting),免疫共沉淀(immunoprecipitation)以及GST-pulldown等分子生物学研究手段,我们发现Shp2表达下调的RBL-2H3肥大细胞相比正常的RBL-2H3肥大细胞,活化后胞内许多重要的信号分子活性都被抑制,这些分子包括Fyn,Akt,JNK,p38MAPK以及Ras/Erk1/2.进一步的研究表明FcεRI活化后,由于Shp2表达下调,信号分子Paxillin的磷酸化水平也被下调,但CbP/PAG的磷酸化不受影响。总之,我们的研究结果表明,IgE受体FcεRI在RBL-2H3细胞膜表面交联后,胞内蛋白Shp2通过调节Fyn和Ras的活性促进了RBL-2H3肥大细胞的活化。Shp2对这个过程的调节不需要CbP/PAG的参与。同时,我们的研究结果揭示Paxillin在FcεRI起始的信号通路中作为Shp2下游的一个间接底物,发挥促进RBL-2H3肥大细胞活化的作用。第二部分Neurokinin1receptor(NK1R)在肥大细胞活化过程中的作用及其机制研究肥大细胞是炎症反应中的主要效应细胞。在特异性抗原的刺激下,肥大细胞借由其表面受体FcεRI的交联启动肥大细胞活化,使之释放大量的炎性介质,促进了炎症的发生发展。因此对肥大细胞活化机制的研究,可以帮助我们找到更特异更有效的治疗炎症疾病的治疗靶点。大量的研究表明,神经肽受体neurokinin1receptor(NKIR)与多种炎症疾病密切相关,提示NKlR可能参与了肥大细胞的活化过程。本部分研究利用RBL-2H3肥大细胞为研究对象,构建特异性耙向NK1R的小发夹RNA(shRNA),通过瞬时转染的方式将shRNA转入野生型RBL-2H3肥大细胞从而下调NK1R在RBL-2H3肥大细胞中的表达水平。构建肥大细胞活化模型,观察NK1R的表达下调对肥大细胞活化的影响,并探讨NK1R在肥大细胞活化过程中所参与的信号调节机制。我们的研究结果显示,RBL-2H3肥大细胞活化后,由于NKlR的表达下调,单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)信使RNA(mRNA)的表达水平明显降低；同时胞内钙离子浓度提升的幅度(钙离子流)也显著地低于NK1R正常表达的细胞。这些结果表明,NK1R在RBL-2H3巴大细胞的活化过程中扮演着重要角色。更进一步,对NK1R在RBL-2H3细胞中的信号调节机制研究发现,NK1R的表达下调导致细胞活化后丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases,MAPKs),包括Erk1/2,JNK及p38MAPK,磷酸化过程被部分抑制,即NK1R的表达下调降低了MAPKs在RBL-2H3细胞活化过程中的活性。这提示NK1R在RBL-2H3肥大细胞的活化过程中参与了对MAPK信号通路的调节。综上所述,本部分的研究结果首次揭示了NK1R在RBL-2H3肥大细胞的活化过程中参与了对MAPK信号通路的调节,并促进MCP-1mRNA合成以及胞内钙离子浓度提高,具有明显的促炎作用。
【作者】方晓云；
【导师】于敏；
【作者基本信息】复旦大学，生物化学与分子生物学，2012，博士
【关键词】Shp2；RBL-2H3肥大细胞；FcεRI；信号通路；活化；Neurokinin1receptor(NK1R)；炎症反应；

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